质粒是一类能在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传的双链超螺旋DNA分子，经过改造后可以接入外源DNA作为基因载体，或者转染细胞包装病毒载体，以及作为DNA疫苗或者mRNA体外转录的模板等。不管是基因治疗，核酸疫苗或者mRNA 模板，质粒都按照较高的GMP生产标准进行工艺的设计与开发，并且系统性的优化质粒的上下游方案，以便获得高产和高质量的质粒产品。
下图展示了百林科可以提供的质粒整体解决方案，包含上游的发酵培养以及下游的纯化处理等工艺需求。本文将重点介绍微生物发酵过程中的关键影响因素以及优化策略，百林科一次性生物反应器系列的设计与优势，典型的质粒发酵应用案例。
图1 百林科的质粒整体解决方案
质粒表达与发酵的关键因素
一般来讲，决定质粒的表达以及质量水平通常跟菌株的选择，质粒载体的设计与构建以及培养基配方，补料策略以及发酵条件设计，发酵过程监控以及放大策略等有较大关系。
01 发酵菌株的选择：选择适合质粒表达的菌株是成功实现高效表达和大规模生产的关键。菌株的选择应基于多个因素，包括目标基因的特性、菌株的生长速度、代谢特点、耐受性和表达能力等。目前大肠杆菌中Top 10 & DH5a 常用于质粒的表达。
02 载体的设计与构建：根据目标基因的特性和表达需求，进行合理的质粒载体设计。常见的质粒载体包括原核表达载体和真核表达载体。
03 发酵培养基的优化：发酵培养基配方不同对菌体生长和质粒表达性能会有显著影响。通过配方优化，提供适当的碳源、氮源、无机盐和辅助因子等营养物质，以满足菌体代谢需求和质粒稳定复制。
04 培养条件的优化：其中温度、pH值、溶氧浓度和搅拌速度等参数会显著影响发酵结果。这些条件的优化需要结合菌株特性和质粒表达要求，通过温度的调整，可以实现较高的生长速度和表达效率。通过调整通气量和搅拌速度来调整溶氧，以满足菌体不同阶段的代谢需求。
05 过程监控与控制：建立全面的发酵过程监测系统可以协助实现高效表达和稳定产量。一般包括在线或离线监测生物量、溶解氧浓度、pH值、营养物浓度以及产物积累等关键参数。通过对监测数据的实时分析和控制策略的调整，可以优化发酵过程的效率和稳定性。
06 放大策略：放大过程中需要考虑发酵罐的尺寸选择、通气设备和搅拌系统的设计，以及相关的操作流程和控制策略。此外，放大过程中应注意扩散和传质问题，以保证质粒表达的均一性和稳定性。
综上所述，要实现高效表达和大规模生产，需选择适合的菌株和质粒载体，优化培养基成分和发酵条件，建立监测与控制系统，并结合合理的放大策略。这些步骤需要深入研究、实验验证和优化，并最终应用于工业化生产中。
百林科CytoLinX®BR 系列生物反应器
在质粒发酵上的主要优势如下
1 高氧传输效率
BR生物反应器采用了先进的气体传输技术和设计，可以提供优异的氧气溶解度和气体液体传质性能，确保菌体在发酵过程中得到充足的氧气供应。
2 优化的温度和pH控制
BR生物反应器配备了高精度的温控和pH控制系统，能够精确控制发酵过程中的温度和pH值，提供理想的环境条件，以大程度地促进细菌生长和质粒表达效率。
3 灵活的体积调节
BR生物反应器具有灵活的体积调节能力，可以适应不同规模的质粒发酵需求。通过添加或移除可互换的工作容器单元，可以快速实现反应器体积的变化。这种可伸缩的设计使得BR生物反应器非常适合从实验室中的小规模研究到工业化生产的大规模应用。
4 全自动化控制系统
BR生物反应器配备了全自动化控制系统，能够实时监测和控制关键参数，如温度、pH值、溶解氧浓度和搅拌速度等。通过这个系统，用户可以对发酵过程进行精确的调节和优化，提高质粒表达的效率和稳定性。
5 方便的操作和样品采集
BR生物反应器的设计注重操作的便利性和样品采集的方便性。人性化的用户界面，提供直观的操作指导和信息显示。还提供了方便的样品采集接口，使得用户可以随时获取发酵样品进行分析和评估。
综上而言，百林科的CytoLinX® BR 生物反应器通过高氧传输效率、优化的温度和pH控制、灵活的体积调节、全自动化控制系统以及方便的操作和样品采集，BR生物反应器能够提供稳定、高效的质粒发酵环境，帮助实现质粒表达的最佳结果。目前CytoLinX® BR MO微生物反应器最大可放大至50L。
图2 百林科CytoLinX®BR生物反应器家族
图3 百林科CytoLinX® BR生物反应器软件特点
质粒发酵的应用案例：
培养条件优化与控制：使用CytoLinX®BR生物反应器进行小规模质粒发酵试验。通过对温度、pH值、氧气传输和搅拌速度等操作参数的优化，提供了最适宜的环境条件以促进菌体生长和质粒表达。通过全自动化的监测和控制系统，实时跟踪关键参数如温度、pH值、溶解氧浓度和营养物浓度等。通过对监测数据进行分析和调整，及时控制发酵过程，以保证质粒表达的效率和稳定性。
优化后的建议培养参数
✦ 温度：37℃，变速补料(流速达到最大)开始后，调整温度为35℃。
✦ 氧气传输率(OTR)：搅拌速度：200-360rpm；通气量：1.0-2.0vvm。
✦ pH值：定期监测并调整，初期7.0，12h后调整为7.2。
✦ 补料策略：营养物流速(NFR)：依据比生长速率调整；加料时间点(Feed timing)：OD600>25开启。
✦ 反馈控制：pH：7.0-7.2；DO：40%。
表1 培养条件优化与控制一览表
图4 CytoLinX®BR 生物反应器培养(E.Coli)过程
工艺放大：在小规模试验成功后，研究人员将发酵条件和操作参数进行了相应的放大，通过增大工作容器单元的数量或调整反应器尺寸，实现了相应的发酵规模扩大。
图5 CytoLinX®BR 50L生物反应器优化后培养(E.Coli)过程
采用百林科的CytoLinX®BR生物反应器，该团队成功实现了目标质粒的高效表达条件优化与生产放大。
图 6 CytoLinX®BR生物反应器培养OD600展示
表2 工艺优化后产量对比
这个案例再次证明了CytoLinX®BR生物反应器在质粒发酵上的应用潜力，可提供高效的氧传输、优化的温度和pH控制、全自动化的监测和控制系统等优势。
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